Una vez más en los últimos años, el Premio Nobel de Química distingue a la Química Biológica. Y es que cuando se conoce la delicadeza y precisión de los mecanismos catalíticos y de reconocimiento de estructuras que tienen lugar entre moléculas biológicas uno solo puede quedar asombrado. Este año, la Academia sueca ha distinguido a tres científicos que fueron pioneros en el descubrimiento de los mecanismos que todas las células tienen para proteger la estructura de la molécula más grande y con más influencia de todas las que una célula contiene: el ADN. Ellos son Tomas Lindahl, que ha desarrollado su actividad en el Imperial Cancer Research Clare Hall, en Londres, Reino Unido; Paul Modrich, del Howard Hughes Institute y Duke University en Durham, North Carolina; y Aziz Sancar, de la North Carolina University en Chapel Hill, North Carolina.
Definamos el escenario. El genoma humano contiene toda la información necesaria para crear un ser humano completo. En cada célula, las moléculas de ADN contenidas en sus 23 cromosomas (en realidad 46 porque cada uno está duplicado) contienen unos 3.000 millones de pares de nucleótidos (pdb de aquí en adelante), la unidad básica de información. Las mitocondrias, unos orgánulos subcelulares, también contribuyen a la información con su pequeño genoma autónomo (unos 16.000 pdb) por lo que a efectos "contables" podemos despreciarlas (pero nunca por su importancia funcional). Pues bien, cada vez que una célula se divide estos 3.000 millones de pdb son replicados y una de las copias pasa a las células hijas. Si la replicación tuviese lugar con precisión absoluta debería cometerse menos de un error por cada 3.000 millones. Una estimación de lo que ocurre es que los enzimas encargados de la replicación cometen un error cada 10.000 pdb. Por eso existen mecanismos correctores de errores que funcionan durante la replicación y que reducen el margen de error a 1 por cada millón de pdb y, finalmente, existen los mecanismos reparadores post-replicativos que reducen el margen de error a 1 por cada 100 millones de pdb. A esto hay que añadir que en estados no replicativos (la mayor parte del tiempo de vida de una célula) el ADN tiene una estabilidad química limitada. Hay procesos de oxidación, de hidrólisis, de modificación química y la acción de las radiaciones que producen cambios estructurales pequeños en las moléculas de ADN pero que pueden ser de una enorme trascendencia en la transmisión de la información genética.
Esta inestabilidad estructural del ADN es a la vez un riesgo y una oportunidad. En conjunto, cada día se producen en nuestro genoma centenares (tal vez miles) de cambios. La mayoría serán corregidos pero los que queden (mutaciones) pueden generar enfermedades como el cáncer o neurodegenerativas o ser el origen de enfermedades transmisibles genéticamente si las mutaciones han tenido lugar en las células germinales (espermatozoides, óvulos y sus precursores respectivos). Pero por otra parte son el origen de la evolución de los organismos. Sin mutaciones no se producirían los cambios que, una vez seleccionados por el medio ambiente, dan lugar a la continua aparición de nuevos organismos. Este delicado equilibrio entre estabilidad genómica y mutación es consustancial a los organismos vivos. Los mecanismos de reparación caracterizados por Lindahl, Modrich y Sancar (y muchos más investigadores) son un elemento esencial para el mantenimiento de este equilibrio, como prueba el hecho de que su alteración puede dar lugar a cambios genéticos mucho más frecuentes o a enfermedades de las mencionadas anteriormente.
En el contexto que acabamos de definir, llamamos lesión a cualquier cambio en la molécula del ADN que pueda tener influencia en la información genética. De ahí que a los mecanismos que tratan de contrarrestar esos cambios los llamemos mecanismos de reparación. Aunque las consecuencias biológicas de determinados agentes químicos y de las radiaciones eran conocidas anteriormente, los mecanismos de reparación del ADN se han ido desentrañando en los últimos 25 años.
El primero en ser conocido es la llamada foto-reactivación y Aziz Sancar ha tenido papel protagonista en ello. Se sabía que la radiación ultravioleta (UV) causaba varios tipos de lesiones en el ADN, siendo el más notable la formación de enlaces carbono-carbono entre dos timinas adyacentes en la estructura del ADN. Estos "dímeros de timina" pueden ser considerados como una sola base nitrogenada en los procesos replicativos; es decir, cada dímero de timinas es una mutación. El trabajo de Sancar sobre este mecanismo se llevó a cabo a lo largo de unos 15 años y empezó con la purificación de un enzima a partir de células de la bacteria Escherichia coli que tenía actividad ADN fotoliasa (esto significa con capacidad de romper enlaces carbono-carbono en el ADN tras su activación por la luz). En una molécula de ADN hay miles de enlaces carbono-carbono pero los hidrolizados por la fotoliasa son precisamente los enlaces "extra" inducidos por la radiación UV. El trabajo posterior puso de manifiesto el extraordinario mecanismo por el que la fotoliasa puede captar la energía de un fotón de la luz activadora e iniciar una serie de reacciones de oxidación-reducción que finalmente conlleva la hidrólisis de los enlaces cuya formación indujo la radiación UV. Al contrario de lo que ocurre con los demás mecanismos de reparación, que son sorprendentemente similares en células de bacteria y en células de mamífero, incluyendo los humanos, la foto-reactivación parece ser un mecanismo exclusivamente presente en las bacterias. ¿Caprichos de la evolución? Quizás es más razonable pensar en presión evolutiva cuando otros mecanismos están presentes.
Además de por foto-reactivación, los daños causados por la radiación UV pueden ser reparados por un mecanismo independiente de la luz que se conoce como reparación por escisión de nucleótidos (NER, de nucleotide excision repair). Este mecanismo, también descubierto originalmente en bacterias, implica que los dímeros de timina son eliminados del ADN por acción de unos complejos enzimáticos que llevan a cabo una sofisticada acción de reconocimiento del daño, eliminación de un fragmento de la cadena de ADN que lo contiene y regeneración de una nueva molécula de ADN en la zona dañada. Los trabajos originales, que se llevaron a cabo en los años 60 del siglo pasado, pusieron de manifiesto un número de genes que se llamaron uvr (de ultraviolet resistant) cuya función era necesaria para que las células se recuperaran del daño causado por la radiación UV. En los años 70 y 80, el laboratorio de Aziz Sancar demostró las funciones de las proteínas uvrA, uvrB, uvrC y uvrD. Resumidamente, un complejo formado por uvrA y uvrB rastrea la molécula de ADN y cuando detecta la anormalidad estructural de un dímero de timinas se para en ese preciso lugar y se orquesta la reparación junto con las otras proteínas uvr y otras proteínas "auxiliares". El mecanismo consiste en que la cadena de ADN que contiene la lesión es escindida con precisión absoluta a ambos lados de la lesión, generándose un fragmento de ADN monocatenario de 13 nucleótidos. Este fragmento monocatenario es desenrollado de la doble hélice por la actividad helicasa de uvrB y uvrD y finalmente una nueva cadena de ADN, que contiene exactamente la misma secuencia de nucleótidos que la anterior pero sin la lesión, es sintetizada por las ADN polimerasas y soldada al resto de la cadena por la ADN ligasa. Al contrario que los mecanismos de foto-reactivación, los de NER han permanecido prácticamente intactos a lo largo de la evolución de manera que las células humanas contienen un sistema uvrABCD en el que la única diferencia apreciada es que el fragmento de ADN monocatenario que se separa durante la reparación contiene 29 nucleótidos. Son especialmente llamativos los casos de las personas que sufren de una condición hereditaria que se denomina Xeroderma pigmentosa (XP). Estos pacientes son extraordinariamente sensibles a la luz solar y tienen una especial propensión a sufrir melanomas y otros tumores de la piel. Pues bien, cuando se han estudiado los diferentes genes mutados que son responsables de estas alteraciones, en todos los casos se ha observado que son genes del sistema uvrABCD. Es decir, los pacientes de XP son mutantes en los que el sistema de reparación NER está dañado. Esto los hace especialmente sensibles a la radiación UV solar. Y como las mutaciones inducidas por ésta en el ADN no pueden ser reparadas, la probabilidad de que contribuyan a la generación de un tumor es mucho más alta que en un individuo normal.
Como se ha comentado al principio, el ADN tiene una cierta inestabilidad estructural, incluso en ausencia de sustancias o radiaciones nocivas. En los años 70 del siglo pasado, Lindahl acuñó el término "DNA decay" (desintegración, degradación) para este fenómeno, aunque propiamente no se produzca una desintegración sino una serie de pequeños cambios que, eso sí, pueden tener enorme influencia en el papel biológico del ADN. Uno de los más notables es la reacción espontánea de desaminación de las bases nitrogenadas que son la esencia del mensaje genético. Y entre ellas es particularmente llamativa la desaminación de la citosina (C) que da lugar a Uracilo (U). El U (salvo el originado de esta forma) se encuentra exclusivamente formando parte del ARN pero cuando forma parte del ADN se empareja muy bien con la Adenina (A), mientras que la C lo hace con la Guanina (G). Esto significa que las desaminaciones de C que no hayan sido reparadas tienen un alto potencial mutagénico en un proceso replicativo posterior puesto que un par de nucleótidos C=G termina por ser un par T=A tras la desaminación de C y la replicación posterior. A partir de la constatación de que el U aparecía con cierta frecuencia en el ADN, Tomas Lindahl inició un estudio que eventualmente llevó a la identificación (también en células bacterianas) de un enzima que se llama Uracil-ADN-glicosidasa. Este enzima es otro ejemplo de la exquisita especificidad de los catalizadores biológicos. Cataliza la hidrólisis del enlace C-N (enlace N-glicosídico, de ahí su nombre) que une el uracilo a la desoxirribosa en el ADN para dejar como producto lo que se conoce como un sitio apurínico en medio de la molécula de ADN. Pero no actúa sobre los enlaces uracilo-ribosa que están presentes muy frecuentemente en el ARN, ni actúa sobre los enlaces uracilo-desoxirribosa si no están en el contexto de una molécula de ADN. Posteriormente, el propio Lindahl y otros descubrieron otras ADN-glicosidasas que se encargan de eliminar del ADN a otras bases nitrogenadas que han sido desaminadas o que han sufrido otra modificación que altera su especificidad de emparejamiento. Todas estas glicosidasas se agrupan para definir un grupo de mecanismos de reparación que se conoce como reparación por escisión de bases (BER, de base excision repair). Los mecanismos BER implican el concurso de endonucleasas que reconocen los sitios apurínicos o apirimidínicos generados por las glicosidasas (AP endonucleasas) y que escinden la cadena que los contiene pero no la complementaria. Finalmente el fragmento de ADN se regenera en un proceso que tiene similitudes con lo que ocurre en los mecanismos NER explicados anteriormente. Como en el caso de los mecanismos NER, los mecanismos BER han permanecido esencialmente inalterados durante la evolución y por eso las células humanas contienen ADN glicosidasas y AP endonucleasas que actúan de la misma manera. El propio Tomas Lindahl demostró en los años 90 que los sistemas de reparación bacteriano y humano se pueden reconstituir en el laboratorio a partir de enzimas purificados.
Como se ha comentado al principio, los mecanismos reparadores post-replicativos (MMR, de Mismatch repair) reducen el margen de error en la replicación a 1 por cada 100 millones de pdb una vez que las polimerasas han completado ésta. Paul Modrich ha intervenido en la investigación de estos mecanismos que, como en los casos anteriores, también se iniciaron en bacterias para después extenderse a organismos más complejos. Es fascinante que estos mecanismos reparadores detecten en la enorme molécula de ADN la pequeña distorsión estructural que significa que dos bases nitrogenadas de una molécula de ADN recién replicado no estén adecuadamente apareadas entre sí. Y todavía más fascinante que discriminen entre la cadena vieja (que actuó como molde en la replicación) y la nueva, en un alarde conservador que presupone que "lo antiguo es lo bueno" y que el error está en "lo nuevo". Esta distinción se hace gracias la actividad de un enzima metiltransferasa que metila a un residuo de Adenina (A) de la secuencia GATC que puede estar hasta a 1000 pdb del emparejamiento incorrecto. Un grupo metilo tiene una masa de 15 Daltons mientras que un fragmento de ADN de 1.000 pdb tiene una masa de unos 700.000 Daltons, pero es suficiente para marcar lo que hay que marcar.
Como quiera que la metiltransferasa está inactiva durante la replicación, el grupo metilo solamente está presente en la cadena vieja y los mecanismos reparadores actuarán sobre la cadena nueva. Los genes codificantes de las proteínas implicadas en la reparación se conocían antes del trabajo de Modrich y se llamaron genes mut (mutH, mutL y mutS). Se llamaron así porque cuando alguna célula tiene en su genoma alguno de ellos que no funciona acumula una gran cantidad de mutaciones (evidentemente por todos los errores que no han podido ser reparados). Las proteínas mut por una parte reconocen el apareamiento incorrecto y por otra inician la reparación escindiendo la cadena de ADN recién sintetizada cerca de la señal de GmetilATC. El error es finalmente subsanado tras la degradación del fragmento de la cadena nueva, su resíntesis por las ADN polimerasas y su soldadura al resto de la molécula de ADN por la ADN ligasa. Durante más de 20 años el laboratorio de Paul Modrich ha caracterizando cada una de estas proteínas (primero las de origen bacteriano y después las de origen humano) para demostrar que los mecanismos son esencialmente idénticos en las bacterias y en el hombre. Hasta tal punto es así que los genes humanos se han llamado MSH (de mutS homolog) y MLH (de mutL homolog). Por eso no es sorprendente que los defectos en estos genes MSH y MLH estén en el origen de algunos tumores humanos como el cáncer colorrectal hereditario no poliposo.
La enorme trascendencia biológica de estos genes reparadores ha hecho que todos ellos se agrupen en la categoría de genes supresores de tumores (TSG), que son aquellos cuya pérdida de función contribuye a la oncogénesis, si bien por su acción pleitrópica se los distingue de otros TSG que tienen acciones más específicas con el nombre en inglés de "care-takers", que podría ser traducido como genes "vigilantes".
Hasta aquí, la historia extraordinaria de estos impresionantes actores biológicos que Sancar, Lindahl y Modrich han contribuido de manera protagonista a dilucidar. Además de éstos, las células tienen otros mecanismos de reparación de los daños causados en el ADN por las radiaciones gamma o los rayos X. Estos son daños de mayor envergadura y los mecanismos de reparación generalmente implican procesos muy complejos de recombinación genética que aún deben esperar algún tiempo hasta que los conozcamos mejor. Tal vez en unos pocos años el Nobel de Medicina o Fisiología o el de Química distinga a alguno de los que ahora se esfuerzan en ello.
