Al amanecer del 16 de septiembre, después de oír misa, los hombres de Menéndez iniciaron la marcha a pie desde San Agustín hacia Fort Caroline. Los 500 soldados que lo acompañaban, tuvieron que ir a pie unos 85 kilómetros. No había caminos. Tuvieron que atravesar ríos, pantanos y frondosos bosques, todo ello bajo los efectos del tremendo viento y las fuertes lluvias del huracán que asolaba sin piedad la zona.
Fueron cuatro días de marcha con el agua por la cintura, abriéndose paso entre la maleza y apenas sin poder descansar. Menéndez iba siempre en cabeza con 30 incondicionales, su guardia de vizcaínos y asturianos que, con sus hachas, abrían el camino para el resto de compañeros. Por fin, al anochecer del cuarto día llegaron a los alrededores de Fort Caroline. El avilesino ordena a sus hombres que se embosquen en la floresta y que procuren dormir algo. Después convoca a sus capitanes, para darles las instrucciones del plan de ataque que llevarán a cabo al amanecer del día siguiente.
Dos horas antes de que las primeras luces del alba apareciesen, las compañías españolas se encontraban en posición de ataque, situadas a tiro de arcabuz de las empalizadas. El acercamiento se había hecho, según el plan trazado, en completo silencio entre la maleza y las altas hierbas. Estaban en posición, esperando las órdenes de Menéndez.
Lo que menos esperaban los franceses, con el temporal que estaban soportando, era un ataque de los españoles, y menos aún desde tierra. Por esa razón, la vigilancia estaba relajada, y las puertas del fuerte abiertas.
Amanecía el día 21 de septiembre, festividad de San Mateo. Menéndez aprieta los dientes, mira al cielo y, desde la primera hilera de guerreros se pone en pie entre las hierbas gritando con voz potente: ¡Atención! A la orden de Menéndez, una larga fila de cinco docenas de arcabuceros se levanta con las mechas prendidas y colocan su arma en posición de disparo. Al oír el grito de Menéndez los franceses, que dormitaban en sus puestos de vigilancia, se levantan para ver qué es lo que está ocurriendo fuera del fuerte. En esos momentos Menéndez de la orden. ¡Fuego! Entonces, un gran estruendo retumba en la lluviosa mañana. La descarga de los arcabuceros levanta una gran humareda y todos los vigilantes franceses, tanto los que estaban en la puerta como los situados encima de la cerca, cayeron abatidos por los disparos. Menéndez desenvaina su espada con la mano derecha y, levantando con la izquierda la bandera blanca con la Cruz de San Andrés, grita con voz poderosa. ¡Por Santiago! ¡A por los luteranos! A continuación se inicia una carrera desenfrenada de los españoles hacia el fuerte, lanzando amenazas y gritos.
Los franceses estaban totalmente desconcertados y no podían dar crédito a lo que estaba ocurriendo. La mayoría estaban a techo, durmiendo, y salían de los barracones a medio vestir, con las armas en la mano. Intentaron oponer resistencia, pero fueron arrollados por la fuerte y sorprendente acometida española. Los arcabuceros de Menéndez forman dos filas delante de los barracones y cuando los franceses salen de ellos se encontraban con descargas cerradas y continuas que los abatían sin remedio. Los pocos que con mucha suerte lograban librarse de las balas eran acometidos y acuchillados con picas y espadas por el resto de los hombres de Menéndez. Los pocos que lograron alcanzar las empalizadas, saltaron despavoridos desde ellas para, una vez fuera del fuerte, salir corriendo hacia los pantanos, intentando lograr abrigo entre la maleza. Los que estaban en la edificaciones más cercanas del puerto, salieron por la parte de atrás del caserío y huyeron hacia el embarcadero, en donde tenían fondeadas tres chalupas. Rápidamente largaron amarras y, remando con todas sus fuerzas río abajo, lograron alcanzar las brumas de la costa y así escapar de una muerte segura.
Los franceses tuvieron 132 bajas en el asalto. Otros 10 más murieron a los pantanos a consecuencia de las heridas sufridas en el fuerte o del ataque de los indios. Solo unos 50 lograron escapar en los navíos. Entre ellos estaban Laudonniér, lugarteniente de Ribault, y el hijo del jefe francés, Jaques Ribault.
Después de haber acabado con toda resistencia en Fort Caroline, Menéndez autoriza que sus hombres se acomoden en los barracones y después se prepara una comida. Después de comer, el avilesino convocó a sus capitanes y les encarga que agrupen a sus respectivas compañías y hagan recuentos de efectivos para, a continuación, darle novedades. El resultado fue que no se encontró ningún cadáver de españoles en el fuerte, pero solamente había 400 hombres. Los 100 que faltaban con respecto a los que habían salido de San Agustín se habían perdido durante la marcha por los pantanos.
Pedro Menéndez bautizó el fuerte con el nombre de San Mateo, por celebrarse ese día la festividad del santo. También ordenó que se quitasen de la puerta principal y del resto de las edificaciones los escudos de armas del reino de Francia, sustituyéndolos por las enseñas de la monarquía de los Austrias españoles. Luego nombra alcaide del fuerte al capitán Gonzalo de Villaroel y le señaló el lugar que consideró más adecuado para hacer una iglesia.
La intención de Menéndez era iniciar el regreso a San Agustín pasados dos días, pues temía el ataque de Ribault en cuanto la tormenta aflojase. Dejaría 300 hombres en San Mateo con el alcaide y el resto regresarían. Sin embargo las quejas de sus hombres, que estaban exhaustos, hicieron a Menéndez desistir de aquellas ideas y solamente partió él hacia San Agustín, acompañado de su fiel guardia de vizcaínos y asturianos en la mañana del día 23 de septiembre de 1565.
A los tres días llegaron a los alrededores del asentamiento español. Cuando estaban a unas horas mandó a varios indios amigos que se adelantasen, para comunicar a los españoles de San Agustín su llegada y la victoria y toma de Fort Caroline. Entonces salieron del asentamiento a recibirle en procesión, con cánticos de alabanza y loas de gracias.
Sin embargo, Menéndez, fiel a su estilo, al día siguiente de su llegada comienza a dar órdenes para preparar la defensa. Las dos chalupas que se encontraban en el puerto deben zarpar cuanto antes para dirigirse con urgencia a Cuba y a La Española, en busca del "San Pelayo" y el resto de sus navíos. Debían de regresar lo más rápido posible con más hombres, pero también con provisiones, armas y municiones, pues Pedro Menéndez temía un ataque francés de forma inminente.
Como él había supuesto, los mejores soldados franceses no estaban en Fort Caroline en el momento del ataque, sino a bordo de los cuatro galeones, al mando del temido Jean Ribault. La suerte aún podía cambiar de bando y para evitarlo había que obrar con mucha rapidez y estar prevenido.
