Después de unos intensos preparativos, Pedro Menéndez parte con su flota desde Cádiz el 27 de junio de 1565. Era la primera hora de la tarde, tenía viento y tiempo favorable y una clara misión, conquistar el territorio de Florida y expulsar a los herejes luteranos que habían usurpado al Rey Felipe el territorio americano. Una tormenta en lontananza le hace tomar la decisión de regresar a puerto y será al día siguiente cuando se produzca la salida definitiva.
Después de superar innumerables contratiempos, llega a San Juan de Puerto Rico a bordo del San Pelayo, el 8 de agosto de 1565. De toda la flota que había partido de Cádiz, Menéndez será el primero en arribar con su barco al puerto americano. Después entra a puerto cinco naves más, todas ellas con desperfectos, por las tormentas que habían tenido que sufrir durante la travesía. El resto de los barcos de la flota estaban por llegar.
Avisado de que el hugonote Ribault se había adelantado y ya debía de encontrarse a las costas de Florida, Menéndez, después de realizar pequeñas reparaciones y hacer acopio de agua y víveres, decide zarpar con los cinco barcos que en ese momento habían llegado a puerto, con la intención de cortarle el paso al francés o, al menos, impedir que se pudiera asentarse y consolidar posiciones en el territorio. Era la mañana del día 15 de agosto. El avilesino divisa las costas de Florida el 23 y, cinco días después, se realiza el primer desembarco. Será el somedano Diego Flórez Valdés el primero en poner pie a tierra en la costa americana, acompañado de unos 70 arcabuceros y otros hombres de apoyo. La orden que recibe del adelantado es la de contactar con los nativos y buscar un lugar adecuado para establecer un campamento, al que se denominará San Agustín, por ser ese día el 28 de agosto.
Menéndez continúa costeando con sus buques hacia al norte, en busca de los franceses. El 4 de septiembre descubre la base francesa, en la desembocadura del río San Juan. Cuatro grandes navíos estaban anclados en el embarcadero, situado frente a las fortificaciones del asentamiento. Después de un infructuoso ataque naval, en el que los barcos franceses se escabulleron entre la bruma que cubría las aguas, y dado que carecía de medios suficientes para realizar un ataque frontal contra el fuerte francés, Menéndez decide volver a San Agustín, ante el temor de que su asentamiento pudiese ser atacado por el enemigo.
El 6 de septiembre, llega con sus naves frente al puerto donde Flórez Valdés había establecido el campamento, y Menéndez ordena desembarcar a los capitanes Juan de San Vicente y Andrés López Patiño, junto con 200 hombres, para buscar un lugar adecuado para hacer una fortificación que pudiese resistir los envites franceses. Juan de San Vicente y Andrés López Patiño se reúnen con Diego Flórez Valdés, que les presenta al cacique de los indios timucuanos, pobladores de aquellas tierras, y cuyo nombre era Seloy.
Los timucua, vivían en poblados rodeados con empalizadas. Las chozas familiares rodeaban una gran casa comunal, situada en el centro del asentamiento. Los indígenas eran nómadas y tenían varios campamentos a los que se desplazaban periódicamente para cazar, marisquear o recoger sus cosechas. Seloy ofreció a los españoles la "casa grande" del poblado costero, cercana al campamento en el que se había establecido Diego Flórez Valdés, para que los españoles se asentasen. Transmitido el ofrecimiento a Menéndez, al avilesino le pareció una buena opción y ordenó reforzar la empalizada y construir un foso que la rodease. Así mismo, ordenó la construcción de otro foso alrededor de la "gran casa grande comunal", junto con un parapeto a base de tierra y haces de leña. Estas construcciones serían el primer fuerte de San Agustín, que fue ocupado por doscientos soldados y trescientos civiles, incluyendo mujeres y niños. El resto del personal se distribuyeron en los espacios disponibles entre las cabañas del poblado.
Cuando todo estuvo concluido, Menéndez decidió poner pie en Florida para tomar posesión del territorio. Era el 8 de septiembre, día de la natividad de Nuestra Señora, y celebración de festividad de la Virgen de Covadonga. Es precisamente esa fecha tan señalada, la que escoge el Adelantado para que tenga lugar el ritual de la toma de posesión del territorio floridano, en nombre del rey Felipe. Pedro Menéndez desembarca a mediodía, con banderas y estandartes desplegados y en medio del estruendo de descargas de artillería y música de trompetas, pífanos y tambores. En tierra lo esperaban gran cantidad de indios timucua, encabezados por su cacique Seloy al que escoltaban sus guerreros principales, todos ellos engalanados con coloridas plumas multicolores y llamativos abalorios.
Menéndez, portaba el estandarte de España, con los cuatro cuarteles de los escudos de Castilla y León, y sus capitanes la bandera blanca con el aspa roja de San Andrés. El almirante planta rodilla en tierra ante la cruz que le presenta el capellán de la tropa, padre Francisco López de Mendoza Grajales, que comienza a entonar un Te Deum Laudamus. A continuación, Pedro Menéndez, adelantado, capitán general de la flota, y gobernador de aquel territorio, besa la cruz y lo mismo hacen sus capitanes. Posteriormente, el avilesino toma solemne posesión de la Florida en nombre de España y del Rey Felipe.
Terminada la ceremonia de toma de posesión, el padre Grajales celebra misa solemne en un improvisado altar y durante la misma, Menéndez toma juramento de fidelidad a los oficiales de la Real Hacienda, al maestre de campo y a los capitanes. Después nombra alcalde de San Agustín a Bartolomé, su hermano, y designa a las personas que van a formar parte, desde ese momento, del cabildo municipal de la ciudad de San Agustín.
Terminados lo ceremoniales va a tener lugar una comida al aire libre, que los españoles comparten con los habitantes del lugar, sentándose en una misma mesa Menéndez con sus capitanes y el cacique Saloy con sus más importantes guerreros. Las viandas que se degustaron fueron las ofrecidas por los propios nativos: pavo silvestre, carne de venado, sopa de tortuga, maíz, frijoles y calabaza. También los españoles ofrecieron sus mejores manjares: cocido de garbanzos y de lentejas, carne de cerdo, pan, bizcocho y vino tinto de Sabugo y de Canarias.
Después, Menéndez procede a inspeccionar trincheras y empalizadas, revisa la instalación de la artillería y da órdenes para que se proceda a descargar rápidamente todo lo que se pudiese de las naos ancladas fuera de la barra del puerto. El 12 de septiembre, la tarea estaba concluida. En un tiempo record, unas ochocientas personas quedaban perfectamente instaladas en la nueva colonia. La característica de Menéndez era la rapidez en todas sus acciones.
Inmediatamente ordena que los barcos mayores de la flota, incluido el San Pelayo, zarpen a Cuba y a la Española, con el fin de que traer a San Agustín refuerzos de personal y alimentos, pero también para preservar a los navíos de un posible ataque francés. En el puerto de San Agustín se quedan varias chalupas y barcos menores que, por sus características podían entrar dentro de la barra. Todo estaba dispuesto para el posible ataque del enemigo?
